Trong quá trình tiến hành các nghiên cứu di truyền, chúng tôi thường gặp phải các mẫu RNA không đủ, chẳng hạn như để nghiên cứu các khối u giải phẫu miệng nhỏ, thậm chí các mẫu tế bào đơn lẻ và các mẫu đột biến gen cụ thể được phiên mã ở mức độ rất thấp trong tế bào người.Tất nhiên, đối với xét nghiệm COVID-19, nếu tăm bông không được đặt đúng chỗ hoặc không đủ số lần trong quá trình lấy mẫu, thì kích thước mẫu sẽ rất thấp, đó là lý do tại sao Ủy ban Y tế và Kế hoạch hóa Gia đình đã ra mắt hai ngày trước và đã vượt qua bài kiểm tra và nếu dụng cụ lấy mẫu axit nucleic không lấy đủ sáu mẫu, bạn có thể báo cáo.
Độ nhạy của thuốc thử rất quan trọng vì chúng ta gặp vấn đề này hay vấn đề kia, vậy chúng ta có thể làm gì để cải thiện độ nhạy của RT-PCR?
Trước khi thảo luận về các giải pháp khả thi, hãy đề cập đến hai vấn đề phức tạp lớn với tình huống mà chúng tôi vừa đề cập.
Trước hết, chúng tôi lo lắng về việc mất RNA khi chúng tôi chỉ có một vài quần thể tế bào trong mẫu của mình.Nếu sử dụng các phương pháp tách và làm sạch truyền thống, chẳng hạn như phương pháp cột hoặc phương pháp kết tủa axit nucleic, thì khả năng cao là một số mẫu sẽ bị thất thoát.Một giải pháp là thêm một phân tử chất mang, chẳng hạn như tRNA, nhưng ngay cả khi đó, không có gì đảm bảo rằng thử nghiệm phục hồi của chúng tôi sẽ ổn.
Vì vậy, một cách tốt hơn là gì?Một lựa chọn tốt cho các tế bào nuôi cấy hoặc các mẫu vi mô là sử dụng phương pháp ly giải trực tiếp.
Ý tưởng là tách tế bào trong 5 phút, giải phóng RNA vào dung dịch, sau đó dừng phản ứng trong 2 phút, sau đó thêm trực tiếp dịch ly giải vào phản ứng sao chép ngược để không bị mất RNA, và cuối cùng đưa trực tiếp cDNA thu được vào. vào phản ứng thời gian thực.
Nhưng điều gì sẽ xảy ra nếu do điểm xuất phát hạn chế hoặc số lượng biểu hiện gen mục tiêu nhỏ, chúng ta có thể tái chế tất cả RNA mà vẫn không cung cấp đủ mẫu để nhận được tín hiệu thời gian thực tốt?
Trong trường hợp này, bước tiền khuếch đại có thể rất hữu ích.
Sau đây là sơ đồ tăng độ nhạy sau khi sao chép ngược.Trước khi bắt đầu, chúng ta cần hỏi hạ lưu những mục tiêu nào mà chúng ta quan tâm, để thiết kế các đoạn mồi cụ thể cho các mục tiêu này để tiền khuếch đại.
Điều này có thể đạt được bằng cách tạo ra mồi hỗn hợp có tối đa 100 cặp mồi và chu kỳ phản ứng từ 10 đến 14 lần.Do đó, một Master Mix được thiết kế đặc biệt cho yêu cầu này là cần thiết để tiền khuếch đại cDNA thu được.
Lý do đặt số chu kỳ từ 10 đến 14 là vì số chu kỳ hạn chế này đảm bảo tính ngẫu nhiên giữa các mục tiêu khác nhau, điều này rất quan trọng đối với các nhà nghiên cứu cần thông tin phân tử định lượng.
Sau khi tiền khuếch đại, chúng tôi có thể thu được một lượng lớn cDNA, do đó độ nhạy phát hiện ở đầu cuối được cải thiện đáng kể, thậm chí chúng tôi có thể pha loãng mẫu và thực hiện nhiều phản ứng PCR thời gian thực để loại bỏ các lỗi ngẫu nhiên có thể xảy ra.
Thời gian đăng: 04-11-2023